Troubleshooting Real-time PCR ASFV: 10 Vấn Đề Thường Gặp & Cách Fix

Troubleshooting Real-time PCR ASFV: 10 Vấn Đề Thường Gặp & Cách Fix

Real-time PCR ASFV fail là cơn ác mộng của mọi PTN — đặc biệt khi có lô mẫu nghi ASF cần kết quả gấp. Bài viết tổng hợp 10 vấn đề thường gặp nhất khi chạy Real-time PCR ASFV, kèm nguyên nhân + cách fix nhanh nhất.

Mục lục:
– 1. Không có amplification trên Positive Control
– 2. PC OK nhưng mẫu thì không (suspect false negative)
– 3. NTC có amplification (contamination)
– 4. Internal Control fail trên mẫu âm
– 5. Ct quá cao đột ngột cho cả batch
– 6. Amplification curve có shape lạ
– 7. Multiplex không phân biệt được target
– 8. Reproducibility kém (Ct dao động lớn)
– 9. Standard curve không linear
– 10. Run thất bại không rõ lý do
– FAQ

Vấn đề 1: Không có amplification trên Positive Control

Triệu chứng: PC không lên đường cong, Ct = N/A hoặc >40.

Nguyên nhân:
– Master Mix hết hạn hoặc freeze-thaw quá 5 lần
– Primer/probe degraded (đặc biệt probe — fluorophore nhạy ánh sáng)
– Positive Control DNA degraded
– Quên thêm Master Mix hoặc Taq polymerase
– Cycling program sai (nhiệt độ annealing quá cao)
– Máy qPCR fail thermal block

Cách fix:

  1. Kiểm tra reagents:
  2. Aliquot Master Mix mới từ tube chưa mở
  3. Pha primer/probe mới từ stock đông

  4. Lấy aliquot PC mới

  5. Kiểm tra workflow:

  6. Pipette calibration (lệch >5% có thể skip thành phần)
  7. Vortex Master Mix kỹ trước aliquot

  8. Spin down ngắn sau khi aliquot

  9. Kiểm tra máy:

  10. Verify thermal block với external thermometer
  11. Calibrate kênh FAM
  12. Thay block nếu sai >0.5°C

→ Pha lô fresh + chạy lại PC. Nếu vẫn fail → contact vendor.

Vấn đề 2: PC OK nhưng mẫu thì không

Triệu chứng: PC có Ct chuẩn (~25-28), nhưng tất cả/đa số mẫu fail.

Nguyên nhân (top 5):

  1. Tách chiết DNA fail — DNA không có/quá thấp
  2. Inhibitor trong mẫu — heparin, hemoglobin, polysaccharide
  3. Mẫu pha loãng quá (nồng độ virus dưới LOD)
  4. DNA degraded — bảo quản kém, freeze-thaw nhiều
  5. Mẫu sai loại (vd lấy phổi thay vì lách)

Cách phân biệt:

→ Đo OD260/280 sau tách chiết:
– 1.6-2.0: DNA tốt
– <1.5: contamination với protein
– 2.0-2.2: contamination với RNA
– > 2.2: nguy cơ degraded

→ Check Internal Control:
– IC âm: inhibition → pha loãng mẫu 1:5 hoặc 1:10
– IC dương: thật sự không có virus

Cách fix:

  1. Pha loãng template DNA 1:5 → giảm inhibitor concentration
  2. Tách chiết lại bằng kit silica column tốt hơn
  3. Spike PCR enhancer (BSA 0.1mg/mL hoặc DMSO 5%)
  4. Test với mẫu khác cùng lợn (vd: nếu máu fail → thử mô)

Vấn đề 3: NTC có amplification (contamination)

Triệu chứng: Negative control (water) lên đường cong, Ct thường 30-38.

⚠️ Đây là vấn đề NGHIÊM TRỌNG — toàn bộ run vô hiệu.

Nguyên nhân:

  • Aerosol từ Positive Control nhiễm vào reagents
  • Pipette không filter tip (carry-over)
  • Bench setup PCR không decontaminate
  • Reagent nhiễm khi pipette
  • Amplicon từ run trước (nếu không có dUTP/UNG)

Cách fix khẩn cấp:

  1. Quẳng tất cả reagents đang dùng — không cố cứu
  2. Decontaminate workspace:
  3. UV light 30 phút
  4. Bleach 10% wipe toàn bộ bench
  5. Đổi pipette set hoặc UV pipette
  6. Khử cồn 70% tay + găng
  7. Pha lô reagent mới từ stock chưa mở
  8. Tách bench: setup PCR và post-PCR (chạy gel/đọc máy) phải khác phòng

Phòng ngừa lâu dài:

  • Luôn dùng filter tips
  • Aliquot reagents thành portion nhỏ (one-time use)
  • Mua kit có dUTP/UNG để degrade amplicon carryover
  • Setup PCR trong PCR cabinet với UV

Vấn đề 4: Internal Control fail trên mẫu âm

Triệu chứng: Mẫu âm tính (ASFV không lên) NHƯNG IC cũng không lên (kỳ vọng IC ~30-35).

Ý nghĩa: Không phân biệt được âm thật với fail do inhibition → kết quả vô hiệu.

Nguyên nhân:

  • Inhibitor mạnh trong mẫu
  • Tách chiết DNA fail hoàn toàn
  • Quên spike IC vào lúc tách chiết
  • IC plasmid degraded
  • Volume IC pha sai (quá ít)

Cách fix:

  1. Pha loãng template 1:10 → giảm inhibitor
  2. Tách chiết lại với kit khác (chuyển silica → magnetic bead)
  3. Spike thêm IC vào reaction (post-extraction IC)
  4. Check IC stock concentration

→ Trong report, ghi rõ “Invalid run — IC inhibition” thay vì kết luận “âm tính”.

Vấn đề 5: Ct quá cao đột ngột cho cả batch

Triệu chứng: Tuần trước PC có Ct = 26, tuần này Ct = 32. Tất cả mẫu cũng Ct cao hơn bình thường ~5-6 Ct.

Tương đương: Mất ~95% sensitivity.

Nguyên nhân:

  • Master Mix bị degrade do bảo quản kém (>5 freeze-thaw, hoặc để 4°C >2 tuần)
  • Primer/probe bị degraded (đặc biệt fluorophore)
  • Lot mới Master Mix kém chất lượng (lot variation)
  • Calibration máy qPCR bị shift
  • Volume reaction sai do pipette miscalibration

Cách fix:

  1. Pha lô fresh Master Mix + primer/probe → chạy PC
  2. Đối chiếu Ct giảm về baseline → đúng vấn đề là reagent
  3. Liên hệ vendor đổi lô nếu kit còn hạn
  4. Calibrate pipette hàng tháng

→ Best practice: Lưu Ct của PC từng run vào QC chart, alert nếu Ct lệch >2 từ trung bình.

Vấn đề 6: Amplification curve có shape lạ

Triệu chứng: Curve không phải sigmoidal classic — có thể:
– Curve “noisy” rất zig-zag
– Curve “humps” giữa chừng
– Drop về 0 sau plateau
– Plateau quá sớm/quá cao

Nguyên nhân:

  • Bubble trong well → fluorescence không stable
  • Optic block dirty
  • Probe degraded (fluorophore detached khỏi quencher)
  • Multiplex spectral overlap
  • Software glitch

Cách fix:

  1. Spin plate down 30 giây trước khi chạy → loại bubble
  2. Lau optic block bằng cồn isopropyl
  3. Re-calibrate kênh fluorescence
  4. Pha probe mới
  5. Update firmware máy

Vấn đề 7: Multiplex không phân biệt được target

Triệu chứng: Khi chạy multiplex ASFV/CSFV/PRRS, kênh FAM (ASFV) lên cùng với HEX (CSFV) cho mẫu đã biết chỉ là ASFV+.

Nguyên nhân:

  • Spectral overlap giữa fluorophore
  • Color compensation matrix sai
  • Probe degraded fluorophore
  • Cross-reactivity primer-probe

Cách fix:

  1. Re-do color compensation calibration:
  2. Chạy 4 well riêng biệt, mỗi well 1 fluorophore tinh khiết
  3. Cập nhật matrix
  4. Confirm bằng singleplex với cùng mẫu
  5. Verify probe quality: chạy probe trên gel hoặc đo OD

Vấn đề 8: Reproducibility kém (Ct dao động lớn)

Triệu chứng: Cùng 1 mẫu chạy 3 ngày khác nhau cho Ct = 28.5, 31.2, 29.8 (CV ~5%).

Tiêu chuẩn: CV của Ct phải <3% cho diagnostic, <5% cho research.

Nguyên nhân:

  • Pipette miscalibration
  • Volume reaction nhỏ (10μL) → variation cao
  • Aliquot reagent không vortex đủ
  • Nhân viên khác nhau (technique variation)
  • Plate seal lỏng → evaporation

Cách fix:

  1. Calibrate pipette mỗi tháng
  2. Tăng volume reaction từ 10μL → 20μL
  3. Aliquot Master Mix theo run, không multi-use
  4. Train nhân viên theo SOP chuẩn
  5. Dùng plate seal optical chất lượng tốt

Vấn đề 9: Standard curve không linear

Triệu chứng: Khi tạo standard curve từ serial dilution, R² < 0.99 hoặc slope không nằm trong range -3.1 đến -3.6.

Tiêu chuẩn standard curve tốt:
– R² > 0.995
– Slope: -3.32 ± 0.3 (efficiency 100% ± 10%)
– Y-intercept: 35-40

Nguyên nhân:

  • Pipette error khi pha dilution
  • Plasmid stock không stable
  • Inhibitor ở mẫu nồng độ thấp
  • Master Mix saturate ở nồng độ cao

Cách fix:

  1. Pha lại serial dilution với pipette mới calibrated
  2. Dùng carrier DNA (yeast tRNA 10ng/μL) trong diluent
  3. Aliquot plasmid stock thành nhiều ống một-lần-dùng
  4. Loại bỏ điểm extreme nếu cần (top hoặc bottom)

Vấn đề 10: Run thất bại không rõ lý do

Triệu chứng: Tất cả well fail — không có amplification nào, ngay cả PC. Nhưng tuần trước run identical works fine.

Cách debug systematic:

  • [ ] Mẫu mới hay cũ?
  • [ ] DNA OD260/280?
  • [ ] Có hemolysis không?
  • [ ] Master Mix freeze-thaw bao lần?
  • [ ] Hạn dùng?
  • [ ] Aliquot vortex/spin đầy đủ?
  • [ ] Pipette calibration?
  • [ ] Volume đúng?
  • [ ] Plate seal kín?
  • [ ] Cycling program đúng?
  • [ ] Calibration kênh FAM?
  • [ ] Thermal block đồng đều?

Checklist 5: Lab environment

  • [ ] Có power outage giữa chừng?
  • [ ] Cleaning chemicals (bleach aerosol)?
  • [ ] UV light tắt khi setup?

→ Đi qua từng checklist, isolate biến bằng cách thay đổi 1 thứ tại 1 lần.

FAQ

Có cần thay master mix sau mỗi tháng không?

Master Mix qPCR bảo quản đúng (-20°C, max 5 freeze-thaw) có thể dùng 6-12 tháng. Quan trọng là theo dõi PC Ct — nếu drift >2 Ct, đổi master mix.

Khi nào nên liên hệ vendor kit?

Nếu fix theo checklist không được sau 2-3 lần thử, hoặc nghi lỗi từ kit (bad lot), liên hệ vendor:
– Cung cấp Ct của PC
– Cung cấp lot number
– Mô tả vấn đề + bước đã thử
– Yêu cầu replacement nếu trong hạn

Validation kit mới mất bao lâu?

2-4 tuần cho validation đầy đủ (LOD, sensitivity, specificity, reproducibility). Có thể dùng RUO sau 1 tuần nếu chỉ test cơ bản.

Có nên tự pha master mix không?

Không nên cho diagnostic routine. Master mix commercial qua QC nghiêm ngặt. Tự pha chỉ phù hợp research.

Khi nào Real-time PCR ASFV có thể fail nhiều run liên tiếp?

Thường do:
1. Lot reagent xấu (báo vendor)
2. Máy qPCR cần service (calibrate)
3. Lab contamination (cần deep decontamination)
4. Nhân viên mới chưa train kỹ

Tổng kết

10 vấn đề thường gặp khi chạy Real-time PCR ASFV — đa số fix được bằng basic troubleshooting + log QC chart. 80% lỗi đến từ:

  1. Reagents (Master Mix, primer/probe degraded)
  2. Workflow (pipette, technique)
  3. Sample (tách chiết, inhibitor)

→ Đầu tư vào SOP chặt chẽ + QC chart + đào tạo nhân viên giúp giảm 90% lỗi.

💼 Cần hỗ trợ kỹ thuật từ chuyên gia?
Đội kỹ thuật Baesan hỗ trợ troubleshoot Real-time PCR ASFV 24/7. Đào tạo + setup SOP miễn phí khi mua kit.
📞 0357 76 49 68

Bài liên quan

Contact Me on Zalo