Hướng Dẫn Lấy Mẫu Xét Nghiệm ASFV Chuẩn WOAH

Chất lượng mẫu là yếu tố quyết định kết quả xét nghiệm ASFV. Mẫu kém = false negative dù dùng kit tốt nhất. Bài viết hướng dẫn quy trình lấy mẫu xét nghiệm ASFV chuẩn WOAH (OIE) Manual 2024 cho thú y, trang trại và phòng thí nghiệm.

Mục lục:
– Nguyên tắc chọn mẫu
– Lấy mẫu trên lợn sống
– Lấy mẫu trên lợn chết (mổ khám)
– Bảo quản và vận chuyển
– Số lượng mẫu khuyến nghị
– Sai sót thường gặp
– FAQ

Nguyên tắc chọn mẫu

ASFV phân bố không đồng đều trong cơ thể lợn. Theo WOAH Manual 2024, thứ tự ưu tiên chọn mẫu:

Cho phát hiện DNA virus (PCR/Real-time PCR):

Lách ⭐⭐⭐⭐⭐ (concentration virus cao nhất)
Hạch lympho (đặc biệt mesenteric, submandibular)
Tonsil (amidan)
Máu EDTA (lợn sống)
Thận

Cho phát hiện kháng thể (ELISA):

Huyết thanh (lợn hồi phục, >10 ngày sau nhiễm)
Dịch trong xoang ngực/bụng (mổ khám)

→ Không dùng: phân, nước tiểu (virus excretion thấp + nhiều inhibitor).

Lấy mẫu trên lợn sống

1. Máu chống đông EDTA (mẫu phổ biến nhất)

Dụng cụ:
– Ống nghiệm EDTA (nắp tím), thể tích 3-5ml
– Kim tiêm 18G (lợn lớn) hoặc 21G (lợn con)
– Syringe 5-10ml
– Cồn 70°, gòn, găng tay

Các vị trí lấy:

Vị trí	Ưu điểm	Nhược điểm
Tĩnh mạch tai	Dễ, không cần cố định mạnh	Khó với lợn nhỏ
Vena cava cranialis	Lấy được nhiều máu	Nguy hiểm nếu kim sai
Tĩnh mạch khoeo (femoral)	Lợn nhỏ	Cần cố định kỹ

Quy trình lấy tĩnh mạch tai:

Cố định lợn bằng dây thòng lọng hoặc giá kẹp
Sát trùng vùng tai bằng cồn 70°
Dùng tay bóp gốc tai → tĩnh mạch nổi rõ
Đâm kim xuôi chiều dòng máu, độ nghiêng 30°
Hút 2-5ml vào syringe
Cho ngay vào ống EDTA → đảo ngược 5-10 lần để chống đông
Ghi nhãn: mã trại, mã lợn, ngày giờ lấy

⚠️ Lưu ý:
– KHÔNG dùng ống nghiệm có heparin → heparin inhibit PCR
– KHÔNG lắc mạnh → vỡ hồng cầu (hemolysis) → inhibit PCR
– Lấy 5ml nếu cần test cả PCR + ELISA

2. Mẫu oral fluid (nước bọt)

Phương pháp không xâm lấn, phù hợp giám sát đàn:

Treo dây thừng cotton (~50cm) trong chuồng 30 phút
Lợn nhai/cắn → dây bão hòa nước bọt
Cho dây vào túi zip + ép lấy dịch (~5-10ml)
Chuyển vào tube + bảo quản 2-8°C

→ Độ nhạy thấp hơn máu 10-100 lần, dùng để sàng lọc đàn, không thay thế test cá thể khi nghi ngờ.

Lấy mẫu trên lợn chết (mổ khám)

⚠️ An toàn sinh học: Mổ khám lợn nghi ASF phải mặc PPE đầy đủ (kính, găng tay, áo bảo hộ, khẩu trang N95). Khu vực mổ khám cách ly với chuồng.

Quy trình mổ khám lấy mẫu:

Dụng cụ:
– Dao mổ + kéo + pince
– Túi zip vô trùng (~20 cái)
– Ống nghiệm 15ml hoặc tube 2ml
– Khay nhôm + đá khô / icepack
– Bút marker không phai

Các mẫu BẮT BUỘC lấy (theo WOAH):

Lách — cắt 5-10g (mảnh ngón tay cái), cho vào túi zip
Hạch lympho mesenteric — 2-3 hạch, mỗi hạch 1g
Hạch dưới hàm + bẹn — 1g mỗi loại
Amidan — toàn bộ 2 bên
Thận — 5g từ vỏ thận
Phổi + tim — nếu có triệu chứng hô hấp

Mẫu thêm cho ELISA/sequence:
– Huyết thanh (nếu lợn chết <6h) — lấy từ tim
– Tủy xương — đùi sau

Bao bì + ghi nhãn:

Mỗi mẫu cho vào:
– 1 túi zip vô trùng (đôi lớp nếu rò rỉ)
– Ghi nhãn ngoài bút marker: mã trại, mã lợn, loại mẫu, ngày
– Tổng hợp tất cả túi vào 1 hộp lớn + băng “Mẫu bệnh phẩm — nghi ASF”

Bảo quản và vận chuyển

Bảo quản trước khi gửi PTN:

Loại mẫu	Thời gian	Nhiệt độ
Máu EDTA	24-48h	2-8°C (tủ lạnh)
Máu EDTA (>48h)	tối đa 1 tuần	-20°C (đông)
Mô (lách, hạch)	24-48h	2-8°C
Mô (>48h)	tối đa 6 tháng	-20°C
Mô (dài hạn)	>6 tháng	-80°C
Huyết thanh	1 tuần	2-8°C, sau đó -20°C
Oral fluid	24h	2-8°C

⚠️ Tránh đông-rã nhiều lần — mỗi lần freeze-thaw làm giảm chất lượng DNA virus 10-30%.

Vận chuyển đến PTN:

Cách đóng gói chuẩn (3-layer packaging):

Lớp 1 (trong cùng):  Ống/túi mẫu trong túi zip kín
Lớp 2 (giữa):         Bông gòn + paper towel hấp thụ
                      Đặt trong hộp nhựa chống vỡ
Lớp 3 (ngoài cùng):   Hộp xốp/carbon + đá khô / icepack
                      Phiếu yêu cầu xét nghiệm
                      Băng dán "Mẫu bệnh phẩm"

Phiếu yêu cầu xét nghiệm cần có:
– Tên trại + địa chỉ
– SĐT liên hệ
– Triệu chứng quan sát + ngày khởi phát
– Số lượng lợn bệnh / chết / tổng đàn
– Yêu cầu xét nghiệm (PCR ASFV? ELISA?)
– Người gửi mẫu + chữ ký

→ Gửi mẫu trong 24h kể từ khi lấy là tốt nhất.

Số lượng mẫu khuyến nghị

Test nghi ngờ (clinical suspect):

Quy mô đàn	Số mẫu lấy
<50 con	Tất cả lợn có triệu chứng (max 10)
50-200	10 mẫu (lợn có triệu chứng + 3 lợn cùng chuồng)
200-1000	15-20 mẫu
>1000	30 mẫu (lấy phân tầng)

Giám sát chủ động (không có triệu chứng):

Theo công thức:

n = ln(α) / ln(1 - p)

Với α = 0.05 (mức tin cậy 95%), p = 5% (prevalence kỳ vọng):
– n ≈ 60 mẫu cho đàn lớn

Trong thực tế VN, thường lấy 30 mẫu/đàn theo lấy mẫu phân tầng (chia đàn theo nhóm tuổi/chuồng).

10 sai sót thường gặp

❌ Dùng ống nghiệm heparin thay vì EDTA → heparin inhibit PCR
❌ Hemolysis do lắc mạnh hoặc kim quá nhỏ
❌ Lấy mẫu sai vị trí (vd lấy mỡ thay vì hạch lympho)
❌ Để mẫu nhiệt độ phòng quá 8h → DNA degraded
❌ Đông-rã nhiều lần → DNA virus bị phá vỡ
❌ Không ghi nhãn rõ ràng → PTN không track được
❌ Không gửi kèm thông tin lâm sàng → khó interpret
❌ Đóng gói lỏng lẻo → mẫu rò rỉ trong vận chuyển
❌ Lẫn mẫu giữa lợn (dụng cụ không khử trùng)
❌ Lấy quá ít mẫu đại diện cho đàn lớn

FAQ

Lấy mẫu lợn chết quá 24h có dùng được không?

Tùy. Nếu lợn chết <12h + giữ lạnh → mẫu vẫn dùng PCR được. Quá 24h ở nhiệt độ phòng → DNA bị degraded, nên gửi PTN cho biết để adjust kết quả.

Có cần đông lạnh nitrogen lỏng không?

Không cần cho PCR/ELISA routine. Nitrogen lỏng dùng cho sequencing dài hạn hoặc cell culture. PCR routine ở -20°C là đủ.

Mẫu lấy bao nhiêu lâu thì hết hạn?

Máu EDTA: 1 tuần ở 4°C, vài tháng ở -20°C, dài hạn ở -80°C
Mô (đông -80°C): vài năm cho PCR
Huyết thanh: 1-2 năm ở -20°C cho ELISA

Lấy mẫu lợn rừng/heo rừng khác lợn nhà thế nào?

Cùng quy trình. Lợn rừng quan trọng vì là nguồn lây trong tự nhiên — cần lấy mẫu ngay khi săn được hoặc tìm thấy xác.

Có cần giấy phép khi vận chuyển mẫu nghi ASF?

Theo Thông tư 25/2016/TT-BNNPTNT, vận chuyển mẫu nghi bệnh truyền nhiễm phải có giấy chứng nhận kiểm dịch từ thú y địa phương. Báo trước cho PTN nhận mẫu để hỗ trợ.

Kết luận

Lấy mẫu đúng = 70% thành công của xét nghiệm. Mọi PTN tốt + kit cao cấp đều thất bại nếu mẫu kém.

3 nguyên tắc vàng:
1. Đúng vị trí — theo WOAH (lách > hạch > tonsil > máu)
2. Đúng dụng cụ — EDTA cho máu, không heparin
3. Đúng bảo quản — 2-8°C trong 24h, đông -20°C cho dài hạn

💼 Cần training lấy mẫu cho nhân viên trại?
Baesan cung cấp khóa đào tạo on-site lấy mẫu + setup phòng xét nghiệm.
📞 0357 76 49 68